Yüksek verimli tarama - High-throughput screening

Yüksek verimli tarama robotları

Yüksek verimli tarama ( HTS ), özellikle ilaç keşfinde kullanılan ve biyoloji ve kimya alanlarıyla ilgili bilimsel deneyler için bir yöntemdir . Kullanma robotik , veri işleme / kontrol yazılımı, sıvı kullanım vasıtalarının ve hassas detektörler, yüksek hacimli tarama hızlı bir şekilde, kimyasal bir genetik ya da farmakolojik testler milyonlarca yapmak için bir araştırmacı sağlar. Bu süreç sayesinde, belirli bir biyomoleküler yolu modüle eden aktif bileşikler, antikorlar veya genler hızla tanımlanabilir. Bu deneylerin sonuçları, ilaç tasarımı ve belirli bir yerin etkileşimsizliğinin veya rolünün anlaşılması için başlangıç ​​noktaları sağlar.

Test plakası hazırlama

Bir robot kolu bir tahlil plakasını tutar

HTS'nin temel laboratuvar gereçleri veya test kabı mikrotitre plakasıdır : kuyu adı verilen küçük, açık bölmelerden oluşan bir ızgaraya sahip, genellikle tek kullanımlık ve plastikten yapılmış küçük bir kap . Genel olarak, HTS için mikroplakalar ya 96, 192, 384, 1536, 3456 ya da 6144 kuyuya sahiptir. Bunların hepsi 96'nın katlarıdır ve 9 mm aralıklı 8 x 12 aralıklı kuyulara sahip orijinal 96 kuyulu mikroplakayı yansıtır. Kuyuların çoğu, deneyin doğasına bağlı olarak test öğeleri içerir. Bu farklı olabilir kimyasal bileşikler bir in, örneğin eritilmiş , sulu çözelti içinde , dimetil sülfoksit (DMSO). Kuyular ayrıca bir tür hücre veya enzim içerebilir. (Diğer kuyucuklar boş olabilir veya deney kontrolleri olarak kullanılması amaçlanan saf solvent veya işlenmemiş numuneler içerebilir .)

Bir tarama tesisi tipik olarak , içerikleri dikkatlice kataloglanan ve her biri laboratuvar tarafından oluşturulmuş veya ticari bir kaynaktan alınmış olabilecek bir stok levhaları kitaplığına sahiptir . Bu stok levhaların kendileri doğrudan deneylerde kullanılmaz; bunun yerine, gerektiğinde ayrı tahlil plakaları oluşturulur. Bir deney plakası sadece tarafından oluşturulan bir stok plaka, bir kopyasıdır pipetleme (genellikle ölçülen sıvı bir miktar nanoliters tamamen boş levhanın tekabül eden gözleri için hazır plaka kuyuları).

Reaksiyon gözlemi

Bir hazırlanmak için tahlil , araştırmacı böyle bir şekilde, üzerine deney yapmak isteyen bazı biyolojik varlık ile plakanın her kuyu doldurur protein , hücreler , ya bir hayvan embriyo . Biyolojik maddenin kuyulardaki bileşikleri emmesine, bağlamasına veya başka şekilde reaksiyona girmesine (veya reaksiyona girmemesine) izin vermek için bir miktar inkübasyon süresi geçtikten sonra, plakanın tüm kuyularında manuel veya bir makine ile ölçümler alınır. Araştırmacı kuyu bileşiklerinin neden olduğu embriyonik gelişimdeki değişiklikleri veya kusurları araştırmak için (örneğin) mikroskopi kullandığında ve bir bilgisayarın kendi başına kolayca belirleyemeyeceği etkileri aradığında manuel ölçümler genellikle gereklidir . Aksi takdirde, özel bir otomatik analiz makinesi kuyular üzerinde bir dizi deney yapabilir (üzerlerinde polarize ışık parlaması ve protein bağlanmasının bir göstergesi olabilen yansıtıcılığın ölçülmesi gibi). Bu durumda, makine, her bir deneyin sonucunu, her bir sayının tek bir kuyudan elde edilen değere eşlenmesiyle, sayısal değerlerin bir ızgarası olarak verir. Yüksek kapasiteli bir analiz makinesi, bunun gibi birkaç dakika içinde düzinelerce plakayı ölçebilir ve çok hızlı bir şekilde binlerce deneysel veri noktası üretebilir.

Bu ilk tahlilin sonuçlarına bağlı olarak, araştırmacı, ilginç sonuçlar veren ("isabet" olarak bilinir) kaynak kuyulardan gelen sıvıyı yeni tahlil plakalarına "kiraz toplayarak" ve ardından yeniden çalıştırarak aynı ekranda takip tahlilleri gerçekleştirebilir. Bu daralmış küme hakkında daha fazla veri toplamak için deney, gözlemleri doğrular ve düzeltir.

Otomasyon sistemleri

Yüksek depolama kapasitesi ve yüksek hızlı erişim için tahlil plakalarını depolamak için bir karusel sistemi

Otomasyon , HTS'nin kullanışlılığında önemli bir unsurdur. Tipik olarak, bir veya daha fazla robottan oluşan entegre bir robot sistemi, numune ve reaktif ekleme, karıştırma, inkübasyon ve son olarak okuma veya algılama için tahlil mikroplakalarını istasyondan istasyona taşır. Bir HTS sistemi genellikle birçok plakayı aynı anda hazırlayabilir, inkübe edebilir ve analiz edebilir, bu da veri toplama sürecini daha da hızlandırır. Şu anda günde 100.000'e kadar bileşiği test edebilen HTS robotları var. Otomatik koloni toplayıcılar , yüksek verimli genetik tarama için binlerce mikrobiyal koloni seçer. uHTS veya ultra yüksek verimli tarama terimi, (2008 dolaylarında) günde 100.000'den fazla bileşiğin taranmasını ifade eder.

Deneysel tasarım ve veri analizi

Aktif bileşikleri tanımlamak için çeşitli bileşiklerin ( küçük moleküller veya siRNA'lar gibi ) hızlı bir şekilde taranması yeteneği ile HTS, son yıllarda üretilen veri oranında bir patlamaya yol açmıştır. Sonuç olarak, HTS deneylerindeki en temel zorluklardan biri, hem kalite kontrol hem de isabet seçimi için uygun deneysel tasarımların ve analitik yöntemlerin geliştirilmesine ve benimsenmesine dayanan veri yığınlarından biyokimyasal önemi toplamaktır. HTS araştırması, Applied Proteomics, Inc.'in Baş Bilim Sorumlusu John Blume tarafından şu şekilde tanımlanan bir özelliğe sahip alanlardan biridir: Yakında, bir bilim insanı bazı istatistikleri veya temel veri işleme teknolojilerini anlamıyorsa, gerçek bir moleküler biyolog olarak kabul edilmeyecek ve böylece basitçe "bir dinozor" olacaktır.

Kalite kontrol

Yüksek kaliteli HTS deneyleri, HTS deneylerinde kritik öneme sahiptir. Yüksek kaliteli HTS tahlillerinin geliştirilmesi, kalite kontrol (QC) için hem deneysel hem de hesaplamalı yaklaşımların entegrasyonunu gerektirir. KK'nin üç önemli yolu, (i) iyi plaka tasarımı, (ii) etkili pozitif ve negatif kimyasal/biyolojik kontrollerin seçimi ve (iii) farklılaşma derecesini ölçmek için etkili KK metriklerinin geliştirilmesi, böylece tahlillerin kalitesiz verilerle yapılmasıdır. kalite belirlenebilir. İyi bir plaka tasarımı, sistematik hataların (özellikle kuyu konumu ile bağlantılı olanlar) belirlenmesine ve sistematik hataların hem QC hem de isabet seçimi üzerindeki etkisini ortadan kaldırmak/azaltmak için hangi normalleştirmenin kullanılması gerektiğini belirlemeye yardımcı olur.

Etkili analitik QC yöntemleri, mükemmel kalitede testler için bir kapı bekçisi görevi görür. Tipik bir HTS deneyinde, pozitif kontrol ile negatif kontrol gibi negatif bir referans arasındaki net ayrım, iyi kalite için bir indekstir. Pozitif kontrol ve negatif referans arasındaki farklılaşma derecesini ölçmek için birçok kalite değerlendirme ölçütü önerilmiştir. Veri kalitesini değerlendirmek için sinyal-arka plan oranı, sinyal-gürültü oranı, sinyal penceresi, tahlil değişkenlik oranı ve Z faktörü benimsenmiştir. HTS tahlillerinde veri kalitesini değerlendirmek için son zamanlarda kesinlikle standardize edilmiş ortalama fark ( SSMD ) önerilmiştir.

Seçimi vur

Bir HTS'de istenen boyutta etkiye sahip bir bileşiğe isabet denir. İsabet seçme işlemine isabet seçimi denir. Yinelemesiz ekranlarda (genellikle birincil ekranlarda) isabet seçimi için analitik yöntemler, tekrarlı olanlardan (genellikle doğrulama ekranlarında) farklıdır. Örneğin, z-skor yöntemi, tekrarı olmayan ekranlar için uygunken, t-istatistiği , tekrarı olan ekranlar için uygundur. Yinelemesiz ekranlar için SSMD hesaplaması, yinelemeli ekranlar için olandan farklıdır.

Birincil ekranlarda kopyasız isabet seçimi için, kolayca yorumlanabilenler ortalama kat değişimi, ortalama fark, yüzde engelleme ve yüzde aktivitedir. Ancak, veri değişkenliğini etkin bir şekilde yakalayamazlar. Her bileşiğin ekranlarda negatif bir referans olarak aynı değişkenliğe sahip olduğu varsayımına dayalı olarak veri değişkenliğini yakalayabilen z-skor yöntemi veya SSMD. Ancak, HTS deneylerinde aykırı değerler yaygındır ve z-skoru gibi yöntemler aykırı değerlere karşı hassastır ve sorunlu olabilir. Sonuç olarak, isabet seçimi için z*-skor yöntemi, SSMD*, B-skor yöntemi ve nicelik tabanlı yöntem gibi sağlam yöntemler önerilmiş ve benimsenmiştir.

Kopyaları olan bir ekranda, her bir bileşik için değişkenliği doğrudan tahmin edebiliriz; sonuç olarak, z puanının ve z* puanının dayandığı güçlü varsayıma dayanmayan SSMD veya t-istatistiğini kullanmalıyız. t-istatistiği ve ilişkili p değerlerinin kullanımıyla ilgili bir sorun, bunların hem örneklem büyüklüğünden hem de etki büyüklüğünden etkilenmeleridir. Ortalama bir fark için testlerden gelirler ve bu nedenle bileşik etkilerin boyutunu ölçmek için tasarlanmamışlardır. Vuruş seçimi için asıl ilgi alanı, test edilmiş bir bileşikteki etkinin boyutudur. SSMD, etkilerin boyutunu doğrudan değerlendirir. SSMD'nin yaygın olarak kullanılan diğer efekt boyutlarından daha iyi olduğu da gösterilmiştir. SSMD'nin popülasyon değeri deneyler arasında karşılaştırılabilir ve bu nedenle, bileşik etkilerin boyutunu ölçmek için SSMD'nin popülasyon değeri için aynı sınırı kullanabiliriz.

Artan verim ve verimlilik için teknikler

Bileşiklerin bir veya daha fazla plaka boyunca benzersiz dağılımları, plaka başına tahlil sayısını artırmak veya tahlil sonuçlarının varyansını azaltmak veya her ikisi için kullanılabilir. Bu yaklaşımda yapılan basitleştirici varsayım, aynı kuyudaki herhangi bir N bileşiğinin tipik olarak birbiriyle veya test hedefiyle, testin gerçek isabetleri tespit etme yeteneğini temelden değiştirecek şekilde etkileşime girmeyeceğidir.

Örneğin, bileşik A'nın 1-2-3 gözlerinde, bileşik B'nin 2-3-4 gözlerinde ve bileşik C'nin 3-4-5 gözlerinde olduğu bir plaka hayal edin. Belirli bir hedefe karşı bu plakanın bir tahlilinde, 2, 3 ve 4 numaralı kuyulardaki bir isabet, bileşik B'nin en olası ajan olduğunu gösterirken, aynı zamanda belirtilen hedefe karşı bileşik B'nin etkinliğinin üç ölçümünü sağlar. Bu yaklaşımın ticari uygulamaları, taranan bileşik çiftleri arasındaki (ikinci dereceden) girişim olasılığını azaltmak için hiçbir iki bileşiğin birden fazla kuyuyu paylaşmadığı kombinasyonları içerir.

Son gelişmeler

Otomasyon ve düşük hacimli tahlil formatları, NIH Kimyasal Genomik Merkezi'ndeki (NCGC) bilim adamları tarafından, her bir bileşik için tam konsantrasyon-tepki ilişkilerinin oluşturulması yoluyla büyük kimyasal kitaplıkların farmakolojik olarak profilini çıkarmak için bir paradigma olan nicel HTS (qHTS) geliştirmek için kullanıldı. Eşlik eden eğri uydurma ve kimyasal bilişim yazılımı ile qHTS verileri , tüm kitaplık için yarı maksimum etkili konsantrasyon (EC50), maksimum yanıt, Hill katsayısı (nH) verir ve yeni oluşan yapı aktivite ilişkilerinin (SAR) değerlendirilmesini sağlar.

Mart 2010'da, damla bazlı mikroakışkanlar kullanan geleneksel tekniklerden 1 milyonda biri maliyetle ( reaktif hacminin 10 −7 katı kullanılarak) 1000 kat daha hızlı taramaya (10 saatte 100 milyon reaksiyon) izin veren bir HTS sürecini gösteren araştırma yayınlandı . Yağ ile ayrılan sıvı damlaları, mikroplaka kuyularının yerini alır ve reaktifler kanallardan akarken analize ve isabetli ayırmaya izin verir.

2010 yılında araştırmacılar, tek bir kamera ile 64 farklı çıkış kanalının floresan ölçümüne izin vermek için mikroakışkan diziler üzerine yerleştirilebilen bir silikon lens tabakası geliştirdiler. Bu işlem saniyede 200.000 damlayı analiz edebilir.

2013 yılında araştırmacılar, bitkilerden elde edilen küçük moleküllerle ilgili bir yaklaşımı açıkladılar. Genel olarak, ilaç keşif sürecinin başlarında yüksek kaliteli kavram kanıtı doğrulamaları sağlamak esastır. Burada güçlü, seçici ve biyoyararlı kimyasal probların tanımlanmasını sağlayan teknolojiler, sonuçta ortaya çıkan bileşiklerin farmasötik bir ürüne dönüştürülmesi için daha fazla optimizasyon gerektirse bile çok önemli bir ilgi konusudur. Güçlü ve biyoyararlı agonistleri tanımlamak için on yıldan fazla bir süredir hedeflenen bir protein olan nükleer reseptör RORa, çok zorlu bir ilaç hedefinin bir örneği olarak kullanıldı. Çan şeklindeki eğri nedeniyle isabetler tarama adımında onaylanır. Bu yöntem, kantitatif HTS yöntemine (aynı anda tarama ve isabet onayı) çok benzer, ancak bu yaklaşımın kullanılması veri noktası sayısını büyük ölçüde azaltır ve 100.000'den fazla biyolojik ilgili bileşiği kolayca tarayabilir.

Geleneksel HTS ilaç keşfinde saflaştırılmış proteinler veya bozulmamış hücreler kullanılırken, teknolojinin son zamanlardaki çok ilginç gelişimi, nematod Caenorhabditis elegans ve zebra balığı ( Danio rerio ) gibi bozulmamış canlı organizmaların kullanımı ile ilişkilidir .

2016-2018'de plaka üreticileri, organoidler ve sferoidler gibi 3D dokularda kanser ilacı keşfini ele almak için HTS'ye uygun testlerin hızlı gelişimini kolaylaştıran ultra düşük yapışkan hücre kovucu yüzeylerin seri üretimine izin vermek için özel kimya üretmeye başladı; fizyolojik olarak daha uygun bir format.

Biyomedikal araştırmalar için akademide HTS kullanımının arttırılması

HTS, büyük ölçüde robotik ve yüksek hızlı bilgisayar teknolojisindeki modern gelişmelerle mümkün kılınan nispeten yeni bir yeniliktir. HTS operasyonunu yürütmek için hala oldukça uzmanlaşmış ve pahalı bir tarama laboratuvarı gerekiyor, bu nedenle çoğu durumda küçük ila orta ölçekli bir araştırma kurumu, kendisi için bir tesis kurmak yerine mevcut bir HTS tesisinin hizmetlerini kullanacaktır.

Akademide üniversitelerin kendi ilaç keşif işletmeleri olma yönünde bir eğilim var. Normalde sadece sanayide bulunan bu tesisler, artık üniversitelerde de giderek daha fazla yer buluyor. Örneğin UCLA , rutin olarak günde 100.000'den fazla bileşiği tarayabilen açık erişimli bir HTS laboratuvarı Moleküler Tarama Paylaşılan Kaynakları (MSSR, UCLA) içerir. Açık erişim politikası, dünyanın her yerinden araştırmacıların uzun fikri mülkiyet müzakereleri olmadan bu tesisten yararlanabilmelerini sağlar. 200.000'den fazla küçük molekülden oluşan bir bileşik kütüphane ile MSSR, batı kıyısındaki tüm üniversitelerin en büyük bileşik güvertelerinden birine sahiptir. Ayrıca, MSSR , küçük molekül çabalarını tamamlayıcı olan tam işlevsel genomik yeteneklere (genom geniş siRNA, shRNA, cDNA ve CRISPR) sahiptir: Fonksiyonel genomik, her bir genin işlevini ilgili bağlamda inceleyen genom geniş ekranlarını yürütmek için HTS yeteneklerinden yararlanır. ya her bir geni nakavt ederek ya da aşırı ifade ederek. Yüksek verimli küçük molekül ekranına paralel erişim ve geniş genom taraması, araştırmacıların küçük bir molekül üzerinde belirli bir hastalık veya etki modu belirleme için hedef tanımlama ve doğrulama gerçekleştirmelerini sağlar. En doğru sonuçlar, "dizili" fonksiyonel genomik kitaplıkları kullanılarak elde edilebilir, yani her kitaplık, tek bir siRNA veya cDNA gibi tek bir yapı içerir. Fonksiyonel genomik, tipik olarak, örneğin epifloresan mikroskopi veya lazer tarama sitometrisi kullanılarak yüksek içerikli tarama ile eşleştirilir .

Illinois Üniversitesi'nde de Minnesota Üniversitesi'nde olduğu gibi HTS için bir tesis bulunmaktadır. Michigan Üniversitesi'ndeki Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Kimyasal Genomik Merkezi'ndeki HTS tesisine ev sahipliği yapmaktadır. Columbia Üniversitesi, biyokimyasal, hücre tabanlı ve NGS tabanlı tarama için mevcut ~300.000 çeşitli küçük molekül ve ~10.000 bilinen biyoaktif bileşik içeren bir HTS ortak kaynak tesisine sahiptir. Rockefeller Üniversitesi bir sahiptir açık erişime HTS Kaynak Merkezi HTSRC (Rockefeller Üniversitesi, HTSRC hangi teklifler 380.000 üzerinde bileşiklerin bir kütüphanesi). Northwestern Üniversitesi'nin Yüksek Verimli Analiz Laboratuvarı, hedef tanımlama, doğrulama, tahlil geliştirme ve bileşik taramayı destekler. Kar amacı gütmeyen Sanford Burnham Prebys Tıbbi Keşif Enstitüsü'nün ayrıca, MLPCN'nin bir parçası olan Conrad Prebys Kimyasal Genomik Merkezi'nde uzun süredir devam eden bir HTS tesisi vardır . Kar amacı gütmeyen Scripps Araştırma Moleküler Tarama Merkezi (SRMSC), MLPCN sonrası enstitüler arasında akademiye hizmet etmeye devam ediyor. SRMSC uHTS tesisi, şu anda 665.000'in üzerinde küçük molekül varlığıyla akademideki en büyük kütüphane koleksiyonlarından birine sahiptir ve çoklu PI hibe girişimlerini desteklemek için rutin olarak tam koleksiyonu veya alt kütüphaneleri tarar.

Amerika Birleşik Devletleri'nde, Ulusal Sağlık Enstitüleri veya NIH, biyolojik araştırmalarda kullanılmak üzere yenilikçi kimyasal araçlar üretmek için ülke çapında küçük molekül tarama merkezlerinden oluşan bir konsorsiyum oluşturdu. Moleküler Kütüphaneler Prob Üretim Merkezleri Ağı veya MLPCN, merkezi bir molekül deposunda tutulan büyük bir küçük molekül kütüphanesine karşı araştırma topluluğu tarafından sağlanan tahlillerde HTS gerçekleştirir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

daha fazla okuma

Dış bağlantılar